概念发酵工程菌

特点：

• 培养基原料廉价
• 生长条件易于控制，生长迅速，产量高，酶活高
• 是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最好还是抗噬菌体能力强的菌株
• 菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
• 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全

发展趋势：

野生菌→诱发基因突变的变异菌→代谢控制育种→基因重组的定向育种

微生物发酵工程的菌种类型及来源

以微生物分类划分的工业发酵微生物种类

1. 细菌
2. 酵母菌
   • 酿酒酵母
   • 假丝酵母用途：假丝酵母的蛋白质和维生素B含量都比啤酒酵母高。它能以尿素 和硝酸盐作氮源，在培养基中不加其它因子即可生长。它能利用造纸 工业中的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、马铃薯淀粉和木材水解液等。 因此能利用假丝酵母来处理工业和农副产品加工业的废弃物，生产可 食用的蛋白质，在综合利用中很有价值。此属中有的菌能转化50％的 糖成为甘油。 假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂
   • 毕赤酵母属此菌分解糖的能力弱，不产生酒精。能氧化酒精，能耐高或较高浓度酒精。常使酒类和酱油产生白花，形成浮膜，为酿造工业中的有害菌，如粉状毕赤氏酵母。此菌对正葵烷，十六烷的氧化能力强，可用石油或农副产 品或工业废料培养，用以生产蛋白。其中的甲醇毕赤酵母可应用在基因工程菌中，用以表达基因工程蛋白。
3. 霉菌
   • 曲霉属曲霉的主要用途：食用色素，生产糖化饲料，有机酸、酶制剂是做酱、酿酒、制醋的主要菌种。主要涉及种：米曲霉、酱油曲霉、黑曲霉
   • 青霉属青霉的主要用途：青霉素、葡萄糖酸
   • 根霉属根霉的主要用途：米酒、黄酒、淀粉糖化菌、有机酸、甾体转化主要涉及种：黑根霉、华根霉、米根霉
   • 毛霉属毛霉的主要用途：腐乳、酱油、 豆豉
4. 放线菌是一类革兰氏阳性菌、单细胞、丝状多核分支的、以孢子形式繁殖的、陆生性很强的原核微生物
5. 担子菌担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。担子菌资源的利用症引起人们的忠实，如多糖、橡胶物质和抗癌药物的研发。
6. 藻类
   • 藻类中隶属原核微生物的蓝绿藻是最早的光合放氧生物，对地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境起了巨大的作用。有不少蓝藻（如鱼腥藻）可以直接固定大气中的氮，以提高土壤肥力，使作物增产。还有的蓝藻为人们的食品，如著名的发菜和普通念珠藻（地木耳）、螺旋藻等。
   • 用藻类将​转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得石油，可占细胞干重的5%～50%，合成的油与重油相同，加工后可转变成汽油、煤油 和其他产品

用途划分的工业微生物种类及特征

1. 与氨基酸生产有关的微生物（初级代谢产物）1956年，日本Kinoshita 揭开了用微生物发酵法生产氨 基酸的新篇章。1964年，上海轻工业研 究所和天厨味精厂开发 奠定了我国氨基酸工业的基础。氨基酸用途广泛 目前，几乎所有的氨基酸都可用发酵法来生产代谢调控——打破累计代谢产物的经济性原则这里将讨论如何控制微生物的正常代谢调节机制，使其累积更多为人们所需要的有用代谢产物。
   1. 应用营养缺陷性菌株以解除正常的反馈调节
   2. 应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节
   3. 控制细胞膜的渗透性应用缺陷型菌株以解除正常的反馈调节在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产 物得到累积。工业上选育了Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒杆菌）的高丝氨酸缺陷型 （Hom-）菌株作为赖氨酸的发酵菌种。由于这个菌种不能合成高丝氨酸脱氢酶 （HSDH）。营养缺陷型是指丧失了合成某种营养物质的能力，在培养基中若不外加这种营养成分就不能正常生长的变异菌株。不仅在发酵用于提高产量、生产新品种，而且在育种上可作为一种标记，在微生物遗传学和代谢研究中是一种重要的工具）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节抗反馈调节突变菌株，就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株， 或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。结构类似物：结构与代谢物质高度相似，可引起细胞调节行为，但又不能被利用。用结构类似物筛选出可以生存下来的就是解除了反馈调节的突变株，被表示为类似物缩写右上角“r”。控制细胞膜的通透性细胞内的代谢产物常常以很高的浓度累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。
2. 与抗生素生产有关的微生物（次级代谢产物）
   • 一、抗生素早期发展
   • 1928年，弗莱明发现了青霉素；
   • 1943年，Waksman和他的学生Schatz发现 了链霉素，完全是人为努力的结果。
   • 从20世纪40年代开始了寻找新的、能高 产抗生素的微生物成为工业微生物领域 的一个重要研究内容。
   • 继弗莱明和Waksman后，日本科学家梅 译滨夫除了发现卡那霉素（kananmycin） 等多个具有临床价值的抗生素外，还提出了酶抑制剂的概念，开创了从微生物次级代谢产物中寻找生理活性物质的新时代。
   • 二、产生抗生素的微生物种类分布
   • 三、抗生素的合成途径1）由初级代谢产物衍生为刺激代谢产物的基本途径①葡萄糖碳架掺入途径②莽草酸途经 ③与核苷有关的途径 ④聚酮体和聚丙酸途径 ⑤氨基酸衍生途径 ⑥甲羟戊酸途径 ⑦其他复合途径初级与次级代谢都受到微生物的代谢调节，在调控上相互影响。 因此在研究次级代谢时候，必须考虑初级代谢。次级代谢中所涉及到 的酶常常与初级代谢的酶不完全一致。
   • 四、抗生素的代谢调控
   1. 选用结构类似物抗性突变株
   2. 筛选自身耐受性突变株
   3. 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株
   4. 筛选形态突变株
3. 与酶制剂生产有关的微生物（酶制剂）
   • 20世纪60-70年代微生物生产淀粉酶、糖化酶、蛋白酶工业的建立， 是现代发酵技术应用的另一个重要进展。
   • 目前业已发现的酶有5000种左右，其中已经利用的有150种左右，工 业生产的酶约60多种，而大量生产的只有20多种，仅占已知酶的很小 一部分。
   • 酶制剂广泛应用于医药工业、食品和轻工业、石油化工
     • 酶试剂盒：医用诊断试剂盒、工业分析试剂盒等
     • 药用酶制剂：胆固醇氧化酶、葡萄糖氧化酶等
     • 食用酶制剂：果胶酶，淀粉酶等
     • 基因工程技术用酶制剂：核酸酶，DNA连接酶，反转录酶等
     • 饲料酶制剂：纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶等
   • 其中，食品用酶作为食品添加剂的一部分，受到严格的控制
4. 基因工程常用的表达系统（生理活性物质）

自然界中目的性地筛选微生物

工业微生物的来源

菌种保藏机构

• 国内外常用菌种保藏机构。
• 大型发酵工厂的菌种保藏室

自然界分离

• 自然界如土壤、水、动植物体是微生物菌种的广泛来源。
• 在特定的生境下可以分离到有特殊能力的微生物菌株。

发酵制品中选育

• 从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌。
• 从酱油中分离蛋白酶产生菌。
• 从噬菌体污染的发酵液中分离抗噬菌体的发酵菌株等。

自然选育菌种的一般过程

• 采样目的是使所选的土样中尽可能含有目标微生物。
• 富集目的是使土样中的目标微生物占优势。
• 分纯 增殖后的微生物培养仍是一个各类微生物的纯合体，必须进行微生物的纯化即纯培养。
• 初筛目的是用快速的手段对大批菌株做出取舍判断。
• 复筛对初筛菌株全面分析，确定生产能力高的菌株。
• 坚定对最后确定的菌株作分类学鉴定。

工业菌种的保藏

1、菌种退化

通常指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理状态和形态特征逐渐减退或消失的现象。

（一）在生产中菌种退化的表现：菌种的发酵力(如糖、氮的消耗)下降、繁殖力 (如孢子的产生)下降、发酵产品的得率降低等。

（二）菌种退化的原因

1.菌种保藏不妥。

2.连续传代，或经诱变得来的新菌株发生回复突变，发生基因突变。

3.菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到某些不利条件，或是失去某些需 要的条件。

4.菌种混杂。在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致原有的性状丢失。

2、菌种的保藏

• 在生产发酵中，具有高产、有重要经济价值的某一代谢产物的主要生产能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于 一个成功的工业发酵过程极为重要。
• 菌种保藏的基本原理：采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，使微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
• 常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏、干燥载体保藏或冷冻干燥保藏、超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。

短期保藏

蒸馏水悬浮法

最简单的保藏方法，将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏，可用于好气性细菌和酵母等。

斜面保藏法

斜面菌种结合定期移接，4℃下直接保藏。每1～3个月后需移接一次，最好不超过3～4代。特别适合非长期保藏以及不能采用低温干燥方法保藏的菌种。但此方法易产生菌株自发突变、易引起菌种的退化甚至死亡。

中期保藏

矿物油浸没保藏

将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保存。 特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。矿物油和液体石蜡都能作为保藏介质，用石蜡保藏时需预先试验看菌株对石蜡是否敏感或是否能利用石蜡为碳源进行生长。保藏时间为1～2年，2 ～3年应作一次存活试验。

干燥载体保藏

将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。此法适用于产芽孢或孢子的微生物保藏。一般细菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麸皮管保藏。

长期保藏

冷冻保藏

菌种以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在超低温冰箱-80℃或液氮-196℃低温下使微生物几乎完全丧失新陈代谢活动。可保存5年而不会发生菌种死亡和变异的问题。

真空冻干保藏

是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前常用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。

微生物发酵高产菌种选育

诱变育种与代谢控制

微生物诱变育种与代谢控制育种

• 定义：诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促使其突变率大幅提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目标的突变株用于生产和研究。诱变育种除能提高产量外，还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺的目的，该方法简单、快速、收效显著仍被广泛采用。
• 原理：染色体畸变和基因突变两大类。

发酵微生物的基因工程与定向进化

一、基因工程育种

定义： 基因工程是一种DNA体外重组技术，是在分子水平上对原有菌株的改造。基本过程：根据需要用人工方法取得供体DNA 上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转入受体细胞，经过复制、转录和翻译, 表达出供体原有的遗传性状。通过基因工程改造的菌株称为工程菌株。应用基因工程手段来进行的育种方法又称为分子育种。

二、定向进化技术

定向进化技术（directed evolution）又称实验室进化 （laboratory evolution）或进化生物技术，是一种在生物体体外（试管中）模拟自然进化机制（随机突变、重组和选择）使 某一蛋白质的基因发生大量变异，并定向选择出人们所期望得到的具有特定性质的蛋白质。通常一个典型的蛋白质定向进化技术涉及3步：多样化突变体库的建立→筛选(选择高性能突变株同时淘汰非功能性突变) →扩增筛选出的突变子，分析蛋白质功能与序列的关系。

种子的扩大培养